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沉淀蛋白质、去除脂肪
目前现行标注是食品(5009.33-2016)食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定，标准中规定了3种方法：第一法 离子色谱法、中亚第二法 分光光度法、硝酸第三法 蔬菜、测定水果中硝酸盐的食品测定 。紫外分光光度法目前大多数企业会选择使用第二法分光光度法。中亚
亚硝酸盐采用盐酸萘乙二胺法测定,硝酸硝酸盐采用镉柱还原法测定。试样经沉淀蛋白质、测定除去脂肪后,食品在弱酸条件下,亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后,再与盐酸萘乙二胺偶合形成紫红色染料,外标法测得亚硝酸盐含量。采用镉柱将硝酸盐还原成亚硝酸盐,中亚测得亚硝酸盐总量,由测得的亚硝酸盐总量减去试样中亚硝酸盐含量,即得试样中硝酸盐含量。
一、硝酸试剂及标准溶液的测定配制
试剂配制：
1 亚铁氰化钾溶液(106g/L):称取106.0g亚铁氰化钾,用水溶解,并稀释至1000mL。
2 乙酸锌溶液(220g/L):称取220.0g乙酸锌,食品先加30mL冰乙酸溶解,用水稀释至1000mL。
3 饱和硼砂溶液(50g/L):称取5.0g硼酸钠,中亚溶于100mL热水中,冷却后备用。
4 氨缓冲溶液(pH9.6~9.7):量取30mL盐酸,硝酸加100mL水,混匀后加65mL氨水,再加水稀释 至1000mL,混匀。调节pH 至9.6~9.7。
5 氨缓冲液的稀释液:量取50mLpH9.6~9.7氨缓冲溶液,加水稀释至500mL,混匀。
6 盐酸(0.1mol/L):量取8.3mL盐酸,用水稀释至1000mL。
7 盐酸(2mol/L):量取167mL盐酸,用水稀释至1000mL。
8 盐酸(20%):量取20mL盐酸,用水稀释至100mL。
9 对氨基苯磺酸溶液(4g/L):称取0.4g对氨基苯磺酸,溶于100mL20%盐酸中,混匀,置棕色 瓶中,避光保存。
10 盐酸萘乙二胺溶液(2g/L):称取0.2g盐酸萘乙二胺,溶于100mL水中,混匀,置棕色瓶中, 避光保存。
11 硫酸铜溶液(20g/L):称取20g硫酸铜,加水溶解,并稀释至1000mL。
12 硫酸镉溶液(40g/L):称取40g硫酸镉,加水溶解,并稀释至1000mL。
13 乙酸溶液(3%):量取冰乙酸3mL于100mL容量瓶中,以水稀释至刻度,混匀。
标准溶液的配制：
亚硝酸钠(NaNO2,CAS号:7632-00-0):基准试剂,或采用具有标准物质证书的亚硝酸盐标准 溶液。
1 亚硝酸钠标准溶液(200μg/mL,以亚硝酸钠计):准确称取0.1000g于110 ℃~120 ℃干燥恒 重的亚硝酸钠,加水溶解,移入 500mL容量瓶中,加水稀释至刻度,混匀。
2 亚硝酸钠标准使用液(5.0μg/mL):临用前,吸取2.50mL亚硝酸钠标准溶液,置于100mL容 量瓶中,加水稀释至刻度。
二、样品预处理
1 乳粉、豆奶粉、婴儿配方粉等固态乳制品(不包括干酪):将试样装入能够容纳2倍试样体积的带盖容器中,通过反复摇晃和颠倒容器使样品充分混匀直到使试样均一化。
2 发酵乳、乳、炼乳及其他液体乳制品:通过搅拌或反复摇晃和颠倒容器使试样充分混匀。
3 干酪:取适量的样品研磨成均匀的泥浆状。为避免水分损失,研磨过程中应避免产生过多的热量。
沉淀蛋白质、去除脂肪，提取制备待测液：
1 干酪:称取试样2.5g(精确至0.001g),置于150mL具塞锥形瓶中,加水80mL,摇匀,超声30min,取出放置至室温,定量转移至100mL容量瓶中,加入3%乙酸溶液2mL,加水稀释至刻度,混匀。于4℃放置20min,取出放置至室温,溶液经滤纸过滤,滤液备用。
2 液体乳样品:称取试样90g(精确至0.001g),置于250mL具塞锥形瓶中,加12.5mL饱和硼砂溶液,加入70 ℃左右的水约60mL,混匀,于沸水浴中加热 15min,取出置冷水浴中冷却,并放置至室温。定量转移上述提取液至200mL容量瓶中,加入5mL106g/L 亚铁氰化钾溶液,摇匀,再加入5mL220g/L乙酸锌溶液,以沉淀蛋白质。加水至刻度,摇匀,放置30min,除去上层脂肪,上清液用滤纸过滤,滤液备用。
3 乳粉:称取试样10g(精确至0.001g),置于150mL具塞锥形瓶中,加12.5mL50g/L饱和硼砂溶液,加入70℃左右的水约150mL,混匀,于沸水浴中加热 15min,取出置冷水浴中冷却,并放置至室温。定量转移上述提取液至200mL容量瓶中,加入5mL106g/L 亚铁氰化钾溶液,摇匀,再加入5mL220g/L乙酸锌溶液,以沉淀蛋白质。加水至刻度,摇匀,放置30min,除去上层脂肪,上清液用滤纸过滤,弃去初滤液30mL,滤液备用。
三、标准曲线制作及亚硝酸盐测定
吸取40.0mL 上述滤液于50mL 带塞比色管中,另吸取0.00 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、 0.80mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL、2.50 mL 亚硝酸钠标准使用液(相当于0.0μg、1.0μg、2.0μg、 3.0μg、4.0μg、5.0μg、7.5μg、10.0μg、12.5μg亚硝酸钠),分别置于50mL 带塞比色管中。
于标准管与试样管中分别加入2mL4g/L对氨基苯磺酸溶液,混匀,静置3min~5min后各加入1mL2g/L盐酸萘乙二胺溶液,加水至刻度,混匀,静置15min,用1cm比色杯,以零管调节零点,于波长538nm处测吸光度,绘制标准曲线比较。同时做试剂空白。
四、亚硝酸盐含量计算
式中:
X1 ——试样中亚硝酸钠的含量,单位为毫克每千克(mg/kg);
m2 ——测定用样液中亚硝酸钠的质量,单位为微克(μg);
1000——转换系数;
m3 ——试样质量,单位为克(g);
V1 ——测定用样液体积,单位为毫升(mL);
V0 ——试样处理液总体积,单位为毫升(mL)。
五、 精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。此方法亚硝酸盐检出限:液体乳0.06mg/kg,乳粉0.5mg/kg,干酪及其他1mg/kg。结果保留2位有效数字。
六、注意事项
①样品必须粉碎均匀，以便充分提取；
②显色时，必须按顺序添加对氨基苯磺酸和盐酸萘乙二胺，不得颠倒顺序；
③认真判定样品的滤液是否澄清、透明、无干扰色；若有干扰色必须进行样品空白扣除实验；
④比色管和容量瓶等这些玻璃器材应该用稀盐酸浸泡24小时，然后用蒸馏水冲洗干净，然后倒扣在比色管架子上，控水，让比色管自然晾干。
⑤用在紫外分光光度计上的比色皿应该处理干净，处理的方法是浸泡在重铬酸钾溶液中，也可以浸泡在乙醇盐酸溶液中，这样处理比色皿就比较干净了。
⑥紫外分光光度计应该做好暗电流校正，应该提前预热半个小时才能使用，预热的目的是让机器更稳定，数据更加的准确。
⑦在配制磺胺等各种溶液的时候，应该使用不含有亚硝酸盐的蒸馏水，这样能保证实验的准确，能保证实验更容易成功。
⑧在做标准曲线的时候，可以自己配制，也可以买现成的标准溶液，在移取的时候，可以用移液管或者是移液枪，但是要经过检验合格，这是很重要的。
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